生物膜因能附著于軟組織，在癌癥、上呼吸道感染等多種疾病的進展中發(fā)揮重要作用。盡管平面基底上影響生物膜形成的因素已得到廣泛研究，但對 3D 基質中生物膜的生長及相互作用的了解仍有限。由于3D生物膜比2D生物膜更復雜且更難治療，開發(fā)能密切模擬軟組織中天然細菌群落化學和力學特性的生物膜模型，對于研發(fā)下一代抗菌化合物和療法至關重要。FAMU-FSU工程學院化學與生物醫(yī)學工程系Subramanian Ramakrishnan教授和 Jamel Ali教授團隊，采用擠出式生物打印，通過構建兩種藻酸鹽基水凝膠并封裝不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌，旨在理解三維基質環(huán)境中粘彈性效應對生物膜的影響。該文章名為“Rheological Characterization and 3D Fabrication of Artificial Bacterial Biofilms”，發(fā)表在ACS Biomaterials Science & Engineering。結果表明，水凝膠表現(xiàn)出剪切稀化行為，并且細菌濃度增加到1×107CFU mL-1對水凝膠前驅體模量和低剪切粘度沒有顯著影響。然而，將細菌濃度提高到1 × 1010CFU mL-1顯著降低水凝膠剪切粘度和模量。利用基于擠出的生物打印，最佳打印參數(shù)(Pr > 0.8)在4天的孵育期內(nèi)對細菌活力的影響最小(>80%)。此外，隨著時間的推移，較低濃度的細菌比細胞濃度較高的水凝膠形成更大的聚集體。總之，3D生物膜生長取決于初始細菌密度和基質剛性影響。進一步開發(fā)物理化學調(diào)整的生物打印細菌群落將有助于了解其3D環(huán)境中的細菌相互作用，并為構建包含生物膜的體外組織模型用于高通量藥物篩選提供技術支撐。
一、背景介紹
細菌常以包裹在胞外聚合物(EPS)中的生物膜形式存在，使其能抵抗惡劣環(huán)境和抗菌治療，導致嚴重感染(如囊性纖維化、癌癥相關感染)并定植于植入物或軟組織(如膽囊、肺)。鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)是此類典型病原體，其生物膜可擴散至深部組織。
傳統(tǒng)生物膜研究多在瓊脂等平面基底上進行，揭示了基底剛度等因素對形態(tài)的影響。然而，這些模型無法模擬慢性感染中常見的、嵌入3D環(huán)境(如軟組織)的生物膜特性及其增強的耐藥性。早期將細菌封裝在3D水凝膠(如海藻酸鹽)中的研究顯示出更高的生理相關性，但仍受限于營養(yǎng)/氧氣梯度問題。
3D生物打印技術，特別是擠出式打印，為解決上述局限提供了潛力。它可精確制造復雜3D結構，模擬天然組織環(huán)境。基于藻酸鹽和明膠等天然聚合物的生物墨水被廣泛探索，但將其用于打印活菌(LM)或生物膜模型仍在發(fā)展中，對高細胞密度下生物墨水流變學特性及其如何影響3D環(huán)境中生物膜生長的理解尚不足。本研究利用擠出式生物打印，在類組織培養(yǎng)條件下構建3D鼠傷寒沙門氏菌生物膜模型。重點研究了，不同初始細菌濃度對兩種分子量藻酸鹽水凝膠前體流變特性和可打印性的影響。 聚合物分子量和初始細菌密度對細菌存活率、聚集體形成及形態(tài)的影響。結果表明，添加不同濃度的細菌對兩種藻酸鹽前體的流變特性無顯著影響，均能實現(xiàn)高可打印性。該3D打印生物膜模型為研究病原菌在類軟組織材料中的相互作用及未來高通量藥物篩選提供了新平臺。
采用SunP Biomaker V2進行基于擠出的3D生物打印。水凝膠被打印為10×10×1 mm的結構，該結構通過CAD軟件預先設計，采用直線填充模式，填充密度為20%，層高達0.5 mm。 將無細胞水凝膠裝入3 mL注射器中，在25°C條件下，使用22號錐形尖端針頭(內(nèi)徑=0.41 mm)進行打印。為表征水凝膠的可打印性，將水凝膠樣品逐層打印在1 mm厚的載玻片上，通過成像評估絲寬和孔徑大小。研究了三種初始接種濃度的鼠傷寒沙門氏菌(1×105、106、107CFU/mL)用于打印載菌結構。將所需濃度的細菌離心pellet，重懸于50 μL 1×PBS中，加入3 mL水凝膠溶液，并用立體移液管反復抽吸混合。載菌水凝膠支架的打印速度為5 mm/s，擠出速率為0.6 mm3/s。生物打印結構用5%(w/v)CaCl?溶液交聯(lián)4分鐘，用PBS溶液沖洗兩次，然后在添加10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)。隨后對載菌結構進行為期4天的培養(yǎng)成像。
三、結果與討論
3.1 水凝膠的流變學
圖2. 未包埋細菌的水凝膠前驅體流變特性。
3.2 封裝細菌濃度的影響
圖3. 包埋不同濃度鼠傷寒沙門氏菌的水凝膠前驅體流變特性。
3.3 細菌濃度對水凝膠可打印性的影響
在固定打印參數(shù)(速度5 mm/s，擠出速率0.6 mm3/s，溫度25°C)下評估了負載不同濃度鼠傷寒沙門氏菌(0至1×107 CFU/mL)的兩種水凝膠的可打印性。使用孔隙因子(Pr)評估打印結構完整性(Pr ≈ 1表示穩(wěn)定，Pr ? 1表示過稀擴散，Pr ? 1表示過稠斷絲)。結果顯示(圖4)，所有測試濃度的水凝膠均成功打印且結構穩(wěn)定(Pr值接近1)。然而，隨著細菌濃度增加，兩種水凝膠的Pr值均呈現(xiàn)輕微下降趨勢，5%LA-5%Gel: Pr從1.02 (無細菌)降至0.96 (1×107CFU/mL)。1.5%MA-5%Gel: Pr從0.96 (無細菌)降至0.88 (1×107 CFU/mL)。細菌濃度 > 1×107CFU/mL (如1×1010 CFU/mL)的水凝膠未評估打印性，因其流變學性質(低剪切粘度)可能導致不穩(wěn)定。
圖4. 細菌濃度增加對5% LA-5% Gel和1.5% MA-5% Gel兩種水凝膠可打印性的影響。
3.4 細菌濃度對存活率與生物膜形成的影響
封裝于兩種水凝膠(5%LA-5%Gel和1.5%MA-5%Gel)中的鼠傷寒沙門氏菌在4天培養(yǎng)期內(nèi)均表現(xiàn)出高存活率(>80%)，且兩者間無顯著差異(圖5c,d)。菌落大小受初始細菌濃度和水凝膠剛度共同影響，低初始濃度(1×105 CFU/mL)形成的微菌落顯著大于高濃度(1×107 CFU/mL)，例如在5%LA-5%Gel中，低濃度菌落第4天平均面積(30,339 μm2)比高濃度菌落大了約4個數(shù)量級(圖6c)。同時，較硬的5%LA-5%Gel(模量~4.7 kPa)中的平均菌落面積也大于較軟的1.5%MA-5%Gel(模量~2.7 kPa)，但低濃度導致更大菌落的趨勢在兩種凝膠中均一致(圖6c)。菌落形態(tài)(圓度)主要受初始濃度影響，高濃度(1×107 CFU/mL)的聚集體在前3天表現(xiàn)出更高的圓度值(更接近圓形)(圖6f,g)。菌落發(fā)展過程表現(xiàn)為，培養(yǎng)初期(第0天)為分散單細胞(圖7)，4天后發(fā)育成大型密集菌落。值得注意的是，微菌落更大的5%LA-5%Gel水凝膠降解更快，導致其打印結構在4天內(nèi)解體，而1.5%MA-5%Gel結構保持較好。
圖5. 隨時間變化水凝膠打印結構中細菌的存活情況
圖 6. 5% LA-5% Gel和1.5% MA-5% Gel水凝膠打印結構中細菌聚集體的形態(tài)變化與發(fā)育過程。
四、討論
本研究開發(fā)了基于藻酸鹽-明膠水凝膠的3D生物打印平臺，用于模擬類軟組織環(huán)境中鼠傷寒沙門氏菌生物膜的形成。發(fā)現(xiàn)特性兩種不同分子量藻酸鹽的水凝膠(5%LA-5%Gel較硬且松弛快，1.5%MA-5%Gel較軟且松弛慢)在交聯(lián)前流變性質相似，但交聯(lián)后力學性能差異顯著。細菌在濃度 ≤ 1×107 CFU/mL時，細菌對水凝膠流變性和可打印性(孔隙因子Pr ~ 1)影響甚微，但濃度高達1×1010 CFU/mL時顯著降低模量并增強剪切稀化，表明微觀結構改變。封裝細菌在兩種凝膠中4天內(nèi)均保持高存活率(>80%)，且菌落大小受初始濃度和水凝膠剛度協(xié)同調(diào)控，低初始濃度和較硬的5%LA-5%Gel環(huán)境均促進形成顯著更大的微菌落。這種差異可能與細菌運動受限、耗竭/橋聯(lián)聚集機制相關，而水凝膠的剛度與應力松弛特性(5%LA-5%Gel的高剛度結合快速松弛)共同創(chuàng)造了利于大菌落形成的微環(huán)境。該平臺揭示了基質力學特性與細菌行為(存活、聚集、形態(tài))之間的復雜雙向相互作用，為研究生物膜在生理相關3D環(huán)境中的行為及開發(fā)抗菌策略提供了重要工具。
五、結論
本研究明確了細菌濃度對藻酸鹽基水凝膠的關鍵影響。初始濃度≤ 1×107 CFU/mL時，水凝膠流變特性和可打印性(基于擠出)幾乎不受影響。然而濃度> 1×107 CFU/mL會顯著增強剪切稀化行為并降低打印分辨率，強調(diào)了精確控制細菌負載量對維持生物打印所需流變性能的重要性。在3D受限環(huán)境中，生物膜聚集體的生長受初始細菌濃度和水凝膠硬度協(xié)同調(diào)控，在更硬且具有特定應力松弛特性的水凝膠中，較低的初始接種濃度會形成更大的生物膜聚集體。這些發(fā)現(xiàn)為設計調(diào)控水凝膠-細菌相互作用的生物材料(用于組織工程、傷口愈合等生物醫(yī)學應用)提供了重要見解，并為開發(fā)基于力學調(diào)控水凝膠的先進生物膜系統(tǒng)奠定了基礎。
六、參考文獻