生物膜因能附著于軟組織，在癌癥、上呼吸道感染等多種疾病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。盡管平面基底上影響生物膜形成的因素已得到廣泛研究，但對(duì) 3D 基質(zhì)中生物膜的生長(zhǎng)及相互作用的了解仍有限。由于3D生物膜比2D生物膜更復(fù)雜且更難治療，開(kāi)發(fā)能密切模擬軟組織中天然細(xì)菌群落化學(xué)和力學(xué)特性的生物膜模型，對(duì)于研發(fā)下一代抗菌化合物和療法至關(guān)重要。FAMU-FSU工程學(xué)院化學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程系Subramanian Ramakrishnan教授和 Jamel Ali教授團(tuán)隊(duì)，采用擠出式生物打印，通過(guò)構(gòu)建兩種藻酸鹽基水凝膠并封裝不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌，旨在理解三維基質(zhì)環(huán)境中粘彈性效應(yīng)對(duì)生物膜的影響。該文章名為“Rheological Characterization and 3D Fabrication of Artificial Bacterial Biofilms”，發(fā)表在ACS Biomaterials Science & Engineering。結(jié)果表明，水凝膠表現(xiàn)出剪切稀化行為，并且細(xì)菌濃度增加到1×107CFU mL-1對(duì)水凝膠前驅(qū)體模量和低剪切粘度沒(méi)有顯著影響。然而，將細(xì)菌濃度提高到1 × 1010CFU mL-1顯著降低水凝膠剪切粘度和模量。利用基于擠出的生物打印，最佳打印參數(shù)(Pr > 0.8)在4天的孵育期內(nèi)對(duì)細(xì)菌活力的影響最小(>80%)。此外，隨著時(shí)間的推移，較低濃度的細(xì)菌比細(xì)胞濃度較高的水凝膠形成更大的聚集體。總之，3D生物膜生長(zhǎng)取決于初始細(xì)菌密度和基質(zhì)剛性影響。進(jìn)一步開(kāi)發(fā)物理化學(xué)調(diào)整的生物打印細(xì)菌群落將有助于了解其3D環(huán)境中的細(xì)菌相互作用，并為構(gòu)建包含生物膜的體外組織模型用于高通量藥物篩選提供技術(shù)支撐。
一、背景介紹
細(xì)菌常以包裹在胞外聚合物(EPS)中的生物膜形式存在，使其能抵抗惡劣環(huán)境和抗菌治療，導(dǎo)致嚴(yán)重感染(如囊性纖維化、癌癥相關(guān)感染)并定植于植入物或軟組織(如膽囊、肺)。鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)是此類典型病原體，其生物膜可擴(kuò)散至深部組織。
傳統(tǒng)生物膜研究多在瓊脂等平面基底上進(jìn)行，揭示了基底剛度等因素對(duì)形態(tài)的影響。然而，這些模型無(wú)法模擬慢性感染中常見(jiàn)的、嵌入3D環(huán)境(如軟組織)的生物膜特性及其增強(qiáng)的耐藥性。早期將細(xì)菌封裝在3D水凝膠(如海藻酸鹽)中的研究顯示出更高的生理相關(guān)性，但仍受限于營(yíng)養(yǎng)/氧氣梯度問(wèn)題。
3D生物打印技術(shù)，特別是擠出式打印，為解決上述局限提供了潛力。它可精確制造復(fù)雜3D結(jié)構(gòu)，模擬天然組織環(huán)境。基于藻酸鹽和明膠等天然聚合物的生物墨水被廣泛探索，但將其用于打印活菌(LM)或生物膜模型仍在發(fā)展中，對(duì)高細(xì)胞密度下生物墨水流變學(xué)特性及其如何影響3D環(huán)境中生物膜生長(zhǎng)的理解尚不足。本研究利用擠出式生物打印，在類組織培養(yǎng)條件下構(gòu)建3D鼠傷寒沙門氏菌生物膜模型。重點(diǎn)研究了，不同初始細(xì)菌濃度對(duì)兩種分子量藻酸鹽水凝膠前體流變特性和可打印性的影響。 聚合物分子量和初始細(xì)菌密度對(duì)細(xì)菌存活率、聚集體形成及形態(tài)的影響。結(jié)果表明，添加不同濃度的細(xì)菌對(duì)兩種藻酸鹽前體的流變特性無(wú)顯著影響，均能實(shí)現(xiàn)高可打印性。該3D打印生物膜模型為研究病原菌在類軟組織材料中的相互作用及未來(lái)高通量藥物篩選提供了新平臺(tái)。
采用SunP Biomaker V2進(jìn)行基于擠出的3D生物打印。水凝膠被打印為10×10×1 mm的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)通過(guò)CAD軟件預(yù)先設(shè)計(jì)，采用直線填充模式，填充密度為20%，層高達(dá)0.5 mm。 將無(wú)細(xì)胞水凝膠裝入3 mL注射器中，在25°C條件下，使用22號(hào)錐形尖端針頭(內(nèi)徑=0.41 mm)進(jìn)行打印。為表征水凝膠的可打印性，將水凝膠樣品逐層打印在1 mm厚的載玻片上，通過(guò)成像評(píng)估絲寬和孔徑大小。研究了三種初始接種濃度的鼠傷寒沙門氏菌(1×105、106、107CFU/mL)用于打印載菌結(jié)構(gòu)。將所需濃度的細(xì)菌離心pellet，重懸于50 μL 1×PBS中，加入3 mL水凝膠溶液，并用立體移液管反復(fù)抽吸混合。載菌水凝膠支架的打印速度為5 mm/s，擠出速率為0.6 mm3/s。生物打印結(jié)構(gòu)用5%(w/v)CaCl?溶液交聯(lián)4分鐘，用PBS溶液沖洗兩次，然后在添加10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)。隨后對(duì)載菌結(jié)構(gòu)進(jìn)行為期4天的培養(yǎng)成像。
三、結(jié)果與討論
3.1 水凝膠的流變學(xué)
圖2. 未包埋細(xì)菌的水凝膠前驅(qū)體流變特性。
3.2 封裝細(xì)菌濃度的影響
圖3. 包埋不同濃度鼠傷寒沙門氏菌的水凝膠前驅(qū)體流變特性。
3.3 細(xì)菌濃度對(duì)水凝膠可打印性的影響
在固定打印參數(shù)(速度5 mm/s，擠出速率0.6 mm3/s，溫度25°C)下評(píng)估了負(fù)載不同濃度鼠傷寒沙門氏菌(0至1×107 CFU/mL)的兩種水凝膠的可打印性。使用孔隙因子(Pr)評(píng)估打印結(jié)構(gòu)完整性(Pr ≈ 1表示穩(wěn)定，Pr ? 1表示過(guò)稀擴(kuò)散，Pr ? 1表示過(guò)稠斷絲)。結(jié)果顯示(圖4)，所有測(cè)試濃度的水凝膠均成功打印且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(Pr值接近1)。然而，隨著細(xì)菌濃度增加，兩種水凝膠的Pr值均呈現(xiàn)輕微下降趨勢(shì)，5%LA-5%Gel: Pr從1.02 (無(wú)細(xì)菌)降至0.96 (1×107CFU/mL)。1.5%MA-5%Gel: Pr從0.96 (無(wú)細(xì)菌)降至0.88 (1×107 CFU/mL)。細(xì)菌濃度 > 1×107CFU/mL (如1×1010 CFU/mL)的水凝膠未評(píng)估打印性，因其流變學(xué)性質(zhì)(低剪切粘度)可能導(dǎo)致不穩(wěn)定。
圖4. 細(xì)菌濃度增加對(duì)5% LA-5% Gel和1.5% MA-5% Gel兩種水凝膠可打印性的影響。
3.4 細(xì)菌濃度對(duì)存活率與生物膜形成的影響
封裝于兩種水凝膠(5%LA-5%Gel和1.5%MA-5%Gel)中的鼠傷寒沙門氏菌在4天培養(yǎng)期內(nèi)均表現(xiàn)出高存活率(>80%)，且兩者間無(wú)顯著差異(圖5c,d)。菌落大小受初始細(xì)菌濃度和水凝膠剛度共同影響，低初始濃度(1×105 CFU/mL)形成的微菌落顯著大于高濃度(1×107 CFU/mL)，例如在5%LA-5%Gel中，低濃度菌落第4天平均面積(30,339 μm2)比高濃度菌落大了約4個(gè)數(shù)量級(jí)(圖6c)。同時(shí)，較硬的5%LA-5%Gel(模量~4.7 kPa)中的平均菌落面積也大于較軟的1.5%MA-5%Gel(模量~2.7 kPa)，但低濃度導(dǎo)致更大菌落的趨勢(shì)在兩種凝膠中均一致(圖6c)。菌落形態(tài)(圓度)主要受初始濃度影響，高濃度(1×107 CFU/mL)的聚集體在前3天表現(xiàn)出更高的圓度值(更接近圓形)(圖6f,g)。菌落發(fā)展過(guò)程表現(xiàn)為，培養(yǎng)初期(第0天)為分散單細(xì)胞(圖7)，4天后發(fā)育成大型密集菌落。值得注意的是，微菌落更大的5%LA-5%Gel水凝膠降解更快，導(dǎo)致其打印結(jié)構(gòu)在4天內(nèi)解體，而1.5%MA-5%Gel結(jié)構(gòu)保持較好。
圖5. 隨時(shí)間變化水凝膠打印結(jié)構(gòu)中細(xì)菌的存活情況
圖 6. 5% LA-5% Gel和1.5% MA-5% Gel水凝膠打印結(jié)構(gòu)中細(xì)菌聚集體的形態(tài)變化與發(fā)育過(guò)程。
四、討論
本研究開(kāi)發(fā)了基于藻酸鹽-明膠水凝膠的3D生物打印平臺(tái)，用于模擬類軟組織環(huán)境中鼠傷寒沙門氏菌生物膜的形成。發(fā)現(xiàn)特性兩種不同分子量藻酸鹽的水凝膠(5%LA-5%Gel較硬且松弛快，1.5%MA-5%Gel較軟且松弛慢)在交聯(lián)前流變性質(zhì)相似，但交聯(lián)后力學(xué)性能差異顯著。細(xì)菌在濃度 ≤ 1×107 CFU/mL時(shí)，細(xì)菌對(duì)水凝膠流變性和可打印性(孔隙因子Pr ~ 1)影響甚微，但濃度高達(dá)1×1010 CFU/mL時(shí)顯著降低模量并增強(qiáng)剪切稀化，表明微觀結(jié)構(gòu)改變。封裝細(xì)菌在兩種凝膠中4天內(nèi)均保持高存活率(>80%)，且菌落大小受初始濃度和水凝膠剛度協(xié)同調(diào)控，低初始濃度和較硬的5%LA-5%Gel環(huán)境均促進(jìn)形成顯著更大的微菌落。這種差異可能與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)受限、耗竭/橋聯(lián)聚集機(jī)制相關(guān)，而水凝膠的剛度與應(yīng)力松弛特性(5%LA-5%Gel的高剛度結(jié)合快速松弛)共同創(chuàng)造了利于大菌落形成的微環(huán)境。該平臺(tái)揭示了基質(zhì)力學(xué)特性與細(xì)菌行為(存活、聚集、形態(tài))之間的復(fù)雜雙向相互作用，為研究生物膜在生理相關(guān)3D環(huán)境中的行為及開(kāi)發(fā)抗菌策略提供了重要工具。
五、結(jié)論
本研究明確了細(xì)菌濃度對(duì)藻酸鹽基水凝膠的關(guān)鍵影響。初始濃度≤ 1×107 CFU/mL時(shí)，水凝膠流變特性和可打印性(基于擠出)幾乎不受影響。然而濃度> 1×107 CFU/mL會(huì)顯著增強(qiáng)剪切稀化行為并降低打印分辨率，強(qiáng)調(diào)了精確控制細(xì)菌負(fù)載量對(duì)維持生物打印所需流變性能的重要性。在3D受限環(huán)境中，生物膜聚集體的生長(zhǎng)受初始細(xì)菌濃度和水凝膠硬度協(xié)同調(diào)控，在更硬且具有特定應(yīng)力松弛特性的水凝膠中，較低的初始接種濃度會(huì)形成更大的生物膜聚集體。這些發(fā)現(xiàn)為設(shè)計(jì)調(diào)控水凝膠-細(xì)菌相互作用的生物材料(用于組織工程、傷口愈合等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用)提供了重要見(jiàn)解，并為開(kāi)發(fā)基于力學(xué)調(diào)控水凝膠的先進(jìn)生物膜系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。
六、參考文獻(xiàn)