一、背景介紹
肝移植雖是終末期肝衰竭的金標準，但供體短缺促使探索替代療法。現(xiàn)有組織工程策略(如微囊化、細胞片)難以模擬肝微環(huán)境且力學強度不足，限制長期療效。3D生物打印通過精準排布細胞與生物材料，為構建可移植肝組織提供新思路。然而，現(xiàn)有研究多采用肝癌細胞系(如HepG2、HepaRG)，其肝特異性功能不足限制了生物打印肝臟組織的功能，且單細胞打印細胞數(shù)量有限，細胞互作缺失導致功能衰退。
本研究提出創(chuàng)新策略：結合化學重編程來源的無基因修飾人多能干細胞(hCiPSCs)與球體生物打印技術。通過PDMS基透氣微孔裝置規(guī)模化培養(yǎng)高活性肝類器官(hCiPSC-HOs)，并基于球體打印構建高密度肝組織模型(3DP-HOs)。相較于單細胞打印，球體打印保留類器官內(nèi)細胞互作，顯著提升肝功能基因(如ALB、CYP3A4)表達，其功能接近原代肝細胞(PHHs)。體內(nèi)實驗表明，3DP-HOs在小鼠肝衰竭模型中顯著提高生存率，促進肝再生并緩解纖維化，且通過宿主血管網(wǎng)絡實現(xiàn)長效氧供與代謝支持。該技術為肝再生醫(yī)學提供了兼具功能性與穩(wěn)定性的新型治療策略。
二、結果
2.1 利用透氧微孔裝置制備高功能 hCiPSC-HOs
本研究基于透氧微孔裝置實現(xiàn)功能性肝類器官(hCiPSC-HOs)的規(guī)模化制備。hCiPSC-HPCs(96% CK19/AFP雙陽性)經(jīng)微孔培養(yǎng)自組裝為球體，其直徑(約95 μm)與細胞活性(>90%，前6天)顯著優(yōu)于傳統(tǒng)2D培養(yǎng)。功能分析顯示，3D球體的白蛋白分泌(峰值9.68±0.65 μg/百萬細胞/24 h)及尿素合成(214.40 ± 31.60 μg/百萬細胞/24 h)于第7天達峰，功能指標接近原代人肝細胞(PHHs)。基因表達(HNF4A、CYP3A4等)與功能實驗(ICG代謝、脂質(zhì)代謝等)證實hCiPSC-HOs具備成熟肝細胞特性，并形成膽管樣極性結構。該技術為構建生物打印肝模型提供了高活性功能單元。
圖3. 基于球體的生物打印肝組織模型確保了 hCiPSC-HOs 的高活性和生物功能。
2.3 RNA測序分析表明hCiPSC-HOs與3DP-HOs基因表達譜相似且肝功能增強
通過RNA測序比較多種細胞模型的基因表達特征，研究發(fā)現(xiàn)：hCiPSC-HOs與3DP-HOs在PCA和層次聚類中呈現(xiàn)高度相似性(圖4A-B)，證實生物打印過程未顯著改變基因表達。差異分析顯示，3DP-HOs較hCiPSC-HOs在膽汁分泌、細胞黏附和氧響應相關基因表達增強，但與PHHs相比，其免疫活性及細胞色素P450介導的藥物代謝能力較弱，而膽固醇/脂肪酸代謝功能更強(圖4A)。值得注意的是，hCiPSC-HOs和3DP-HOs的基因表達與PHHs的差異顯著小于hCiPSC-Heps。進一步分析發(fā)現(xiàn)，hCiPSC-HOs較hCiPSC-Heps呈現(xiàn)肝臟功能基因上調(diào)(332個共同差異基因)，尿素循環(huán)相關通路顯著激活，同時肝祖細胞和炎癥標志物下調(diào)(圖4C-F)。熱圖顯示3DP-HOs與hCiPSC-HOs在尿素循環(huán)和代謝轉(zhuǎn)錄因子表達上明顯高于其他組，而肝祖細胞標志物表達更低(圖4G-H)。GSEA證實hCiPSC-HOs在氨基酸分解代謝和PPAR信號通路上具有優(yōu)勢(圖4I)。綜上所述，hCiPSC-HOs經(jīng)生物打印后仍維持優(yōu)越的肝臟代謝功能，其成熟度顯著優(yōu)于hCiPSC-Heps。
圖 4. RNA測序分析顯示hCiPSC-HOs與3DP-HOs基因表達譜相似且肝功能增強
2.4 3DP-HOs移植有效救治CCl4誘導的慢加急性肝衰竭小鼠
將3DP-HOs植入CCl?誘導的急性慢加急性肝衰竭(ACLF)小鼠模型(圖5A)后，治療組7天生存率達85.7%，顯著優(yōu)于無細胞假手術組(0%)及空白組(0%)。植入肺癌細胞來源的3DP-A549組小鼠7天內(nèi)全部死亡，證實3DP-HOs療效具有細胞特異性。3DP-HOs組生存率與正常對照組無差異(圖5B)，且血清中人白蛋白(hALB)水平顯著高于PHH移植組(第1/7天分別為26和32 μg/mL，圖5C)。該組肝損傷標志物(ALT、AST等)在7天內(nèi)恢復至正常水平(圖5D)，H&E及TUNEL染色顯示肝組織壞死、充血及凋亡減少，Masson等染色證實纖維化顯著緩解(圖5E)。
圖 5. 3DP-HOs植入挽救CCl?誘導的慢加急性肝衰竭(ACLF)模型小鼠。
2.5 3DP-HOs移植挽救Fah?/?肝衰竭小鼠
將3DP-HOs植入模擬人類I型酪氨酸血癥的Fah?/?肝衰竭小鼠模型(圖6A)。治療60天后，3DP-HOs組生存率達80%，顯著高于假手術組、空白組及3DP-A549組(均無存活)，且體重恢復趨勢與正常對照組相似(圖6B-C)。移植后30天和60天血清中持續(xù)檢測到人ALB(圖6D)，且分泌水平隨時間遞增，提示3DP-HOs內(nèi)肝細胞可能在體內(nèi)微環(huán)境中增殖或功能增強。該組肝損傷標志物(ALT、AST等)顯著降低(圖6E)，H&E及TUNEL染色顯示肝組織壞死、凋亡減少，Ki67染色證實細胞增殖活躍(圖6F)。基因分析表明，3DP-HOs組炎癥/纖維化相關基因(如Il-1β、Trp53)表達顯著下調(diào)，肝功能基因(Alb、Cyp2e1)及增殖基因Mki67上調(diào)，部分指標與正常組無差異(圖6G)。盡管血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平較假手術組顯著下降，但仍高于正常組，提示殘留炎癥(圖6H)。
進一步評估 3DP - HOs - C2/C19。結果顯示，結果顯示其移植組生存率顯著提高，血清hALB持續(xù)分泌，肝損傷標志物降低。組織學分析證實其促進肝再生、減少凋亡及炎癥。3DP - HOs - C1、C2、C19 在兩種肝衰竭小鼠模型中驗證了治療效果，突顯其廣泛適用性及體內(nèi)治療的巨大潛力。
圖 6. 3D生物打印肝類器官(3DP-HOs)移植挽救Fah基因敲除(Fah?/?)肝衰竭小鼠。
2.6 3DP-HOs促進血管生成并維持高細胞活性功能治療Fah?/?肝衰竭小鼠
圖 7. 3DP-HOs促進血管化并維持高細胞活性治療Fah?/?肝衰竭小鼠
三、討論
本研究采用基于hCiPSCs的肝類器官(hCiPSC-HOs)結合球體生物打印技術構建功能性肝組織模型(3DP-HOs)。通過PDMS基透氣微孔裝置增強氧供，實現(xiàn)大規(guī)模高活性hCiPSC-HOs制備。與傳統(tǒng)方法(如直接肝細胞移植易引發(fā)免疫排斥，微囊化移植受限于氧擴散不足)相比，3DP-HOs利用GelMA水凝膠構建網(wǎng)格結構，其互連微通道促進氧/營養(yǎng)傳輸，顯著提高細胞存活率，且植入60天后仍保持完整結構(圖7A)，可安全取出。RNA測序顯示，3DP-HOs在打印前后基因表達譜高度一致(圖4A-B)，雖較原代肝細胞(PHHs)存在藥物代謝(如細胞色素P450活性)及免疫功能差距，但其成熟度顯著優(yōu)于hCiPSC-Heps(圖4)。
在CCl4誘導的ACLF及Fah?/?酪氨酸血癥小鼠模型中，3DP-HOs均顯著提高生存率，降低肝損傷標志物及炎癥因子(IL-1β、TNF-α)，并緩解纖維化(圖5-6)。長期治療中，3DP-HOs促進肝再生(Ki67表達上調(diào))，且通過宿主血管網(wǎng)絡實現(xiàn)氧/營養(yǎng)供給及代謝物清除(圖7C-D)。組織學證實其結構內(nèi)形成功能性血管(CD31)，并與肝細胞(ALB)緊密互作(圖7D)。
未來研究需優(yōu)化生物墨水：天然水凝膠(如海藻酸、膠原)雖具生物相容性但力學性能不足；合成水凝膠(如PEG)可調(diào)控力學但缺乏生物活性。開發(fā)合成-天然雜化墨水或動態(tài)交聯(lián)策略有望平衡性能。規(guī)模化應用需解決細胞量(約5×109個)及氧供難題，結合氧釋放材料(CaO2納米顆粒)及灌注生物反應器或可突破限制，推動功能性肝組織模型的臨床轉(zhuǎn)化。
四、結論
3DP-HOS與使用基于單核的生物打印制造的模型相比，顯示出增強的細胞活力，并表現(xiàn)出與HCIPSC-HOS相似的基因剖面，同時保持乳膠特異性功能。此外，3DP-HOS植入可顯著提高CCL4誘導的急性智力肝衰竭的小鼠的存活率，以及肝衰竭的Fah?/? 小鼠。 3DP-HOS顯著降低了肝損傷，炎癥和纖維化指數(shù)，同時促進肝臟再生和生物功能表達。我們的生物打印肝組織模型對肝衰竭具有顯著的治療功效，并具有在肝臟再生醫(yī)學領域進行臨床研究的巨大潛力。
五、參考文獻