臨界尺寸骨缺損(CSBDs)的臨床修復(fù)面臨內(nèi)源性干細(xì)胞匱乏與炎癥微環(huán)境雙重挑戰(zhàn)。本研究融合3D生物打印與骨免疫調(diào)控策略，構(gòu)建多功能LUT@ZIF-8/GelMA水凝膠支架，以ZIF-8納米顆粒負(fù)載木犀草素提升藥物緩釋性能，協(xié)同Zn2?釋放實現(xiàn)抗菌-成骨-免疫調(diào)節(jié)三重功效。優(yōu)化GelMA水凝膠力學(xué)性能，通過RGD基序促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)黏附增殖。體外實驗證實支架可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化，分泌IL-4/IL-10等抗炎因子，逆轉(zhuǎn)炎癥微環(huán)境對成骨分化的抑制。體內(nèi)顱骨缺損模型顯示支架顯著促進(jìn)新生骨形成，Micro-CT與組織學(xué)分析證實其骨再生效率優(yōu)于對照組。該研究為骨組織工程提供了兼具干細(xì)胞遞送與免疫微環(huán)境重塑功能的智能化修復(fù)平臺。
圖1. 用于骨再生的LUT@ZIF-8/GelMA生物打印支架的示意圖。
二、材料和方法
2.1 3D水凝膠支架的生物打印
LUT@ZIF-8/GelMA生物墨水的制備流程如下：首先將50 mg苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸鋰(EFL，中國)溶于10 mL PBS溶液，45℃間歇攪拌15 min。隨后將500 mg GelMA(EFL，中國)加入5 mL LAP溶液中，65℃避光加熱15 min。滅菌后，將LUT@ZIF-8納米顆粒懸液按1:1(v/v)與GelMA溶液混合，超聲處理5 min形成均質(zhì)生物墨水。使用23G針頭的5 mL注射器裝載生物墨水，置于3D生物打印機(jī)BM2i(Sunp，中國)中，設(shè)置打印頭與平臺溫度分別為18-22℃和18℃，打印速度與擠出速度分別為5 mm/min和2 mm/min。405 nm波長紫外光(0.5 W/cm2)固化成型。封裝rBMSCs時，將細(xì)胞以1.5×10?cells/mL密度混懸于生物墨水中進(jìn)行打印。
三、結(jié)果與討論
3.1 ZIF-8和LUT@ZIF-8納米顆粒的表征
ZIF-8和LUT@ZIF-8納米顆粒在室溫下成功合成(圖2A)，懸浮液分別呈乳白色和姜黃色(圖2B)。TEM顯示兩者均呈現(xiàn)均勻菱形十二面體形貌，但LUT@ZIF-8粒徑更大且邊緣模糊(圖2C-D)。XRD與FTIR分析表明，LUT@ZIF-8保留了ZIF-8晶體結(jié)構(gòu)特征峰，且未檢測到木犀草素特征峰，證實藥物被有效封裝(圖2F-G)。Zeta電位分析顯示木犀草素負(fù)載使納米顆粒表面電荷由+10.5 mV轉(zhuǎn)為-6.1 mV(圖2H)，有利于成骨分化和免疫調(diào)節(jié)。
熱重分析顯示LUT@ZIF-8因木犀草素分解產(chǎn)生更大質(zhì)量損失，羥基與Zn2+配位延緩了早期降解(圖2I)。紫外光譜驗證藥物負(fù)載效率達(dá)16.72%(圖2J)。pH響應(yīng)性釋放實驗表明，酸性環(huán)境下24小時內(nèi)釋放達(dá)平臺期，中性條件釋放平穩(wěn)，提示ZIF-8在體液復(fù)雜環(huán)境中仍可通過水凝膠整合優(yōu)化緩釋性能(圖2K)。
圖2. ZIF-8和LUT@ZIF-8納米顆粒的表征。
3.2 水凝膠支架的表征
本研究開發(fā)了負(fù)載LUT@ZIF-8納米顆粒的GelMA生物墨水(圖3A)，通過3D打印構(gòu)建多孔支架(圖3E)。掃描電鏡顯示支架呈規(guī)則網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，納米顆粒均勻分散于水凝膠基質(zhì)(圖3F)。力學(xué)測試表明，ZIF-8/GelMA與LUT@ZIF-8/GelMA組彈性模量比純GelMA組有所提升，但木犀草素單獨負(fù)載會降低光交聯(lián)效率(圖3G-H)。溶脹實驗顯示含ZIF-8組溶脹率較低，24小時達(dá)平衡(圖3I)，降解速率適中(圖3J)，為細(xì)胞遷移提供空間。藥物緩釋實驗證實LUT@ZIF-8/GelMA支架在14天內(nèi)持續(xù)釋放木犀草素，通過GelMA基質(zhì)延緩ZIF-8降解，實現(xiàn)長效免疫調(diào)控。生物相容性測試顯示0.04% LUT@ZIF-8濃度下rBMSCs存活率最佳(圖3B)，親水性材料特性促進(jìn)抗炎因子分泌。
圖3. 水凝膠支架的表征。
3.3 水凝膠支架的抗菌性能
針對骨缺損常見感染風(fēng)險，評估水凝膠支架對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用(圖4A)。菌落計數(shù)顯示，LUT@ZIF-8/GelMA與ZIF-8/GelMA組顯著降低菌落數(shù)量(圖4B)，24小時后細(xì)菌存活率分別下降至23.5%和28.7%(圖4C-D)。活/死菌染色顯示，含ZIF-8組紅色熒光比例顯著增加(圖4E-G)，證實其強(qiáng)效抗菌作用。抗菌機(jī)制歸因于Zn2?破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，以及木犀草素抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的雙重協(xié)同效應(yīng)。LUT/GelMA組因藥物濃度不足僅表現(xiàn)微弱抗菌活性。
圖4. 水凝膠支架的抗菌活性和生物相容性。
3.4 生物打印支架的生物相容性和細(xì)胞毒性
通過生物打印構(gòu)建載有大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)的支架評估其細(xì)胞封裝性能，同時制備空白水凝膠支架研究其對巨噬細(xì)胞增殖的影響(圖5A)。CCK-8檢測顯示各組細(xì)胞增殖隨時間顯著增強(qiáng)，活/死染色證實細(xì)胞均勻分布且存活良好(圖5B-C)。第5天TRITC-鬼筆環(huán)肽染色顯示LUT@ZIF-8/GelMA組細(xì)胞伸展更顯著，表明其更優(yōu)的細(xì)胞擴(kuò)展性能(圖5D)。第7天所有組別均呈現(xiàn)良好細(xì)胞延展，證實水凝膠基質(zhì)成功模擬細(xì)胞外基質(zhì)特性。RAW264.7細(xì)胞實驗表明各組支架3天內(nèi)均無細(xì)胞毒性(圖5E)。結(jié)果表明，LUT@ZIF-8納米顆粒在適宜濃度下保持良好生物相容性，生物打印支架既能支持rBMSCs增殖擴(kuò)展，又不影響巨噬細(xì)胞正常增殖。
圖5. 水凝膠支架的生物相容性。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨組織工程的核心種子細(xì)胞，既能直接成骨分化，又能通過旁分泌促進(jìn)組織修復(fù)。針對骨缺損區(qū)干細(xì)胞不足的問題，負(fù)載rBMSCs的支架可顯著提升骨再生效果。本研究通過ALP染色、茜素紅(ARS)染色及基因蛋白檢測評估水凝膠支架成骨性能(圖6A)。結(jié)果顯示，LUT@ZIF-8/GelMA組ALP活性顯著高于對照組(圖6B-D)，礦化結(jié)節(jié)密度與成骨基因(RUNX2/COL1A1/ALP/OCN)表達(dá)均最優(yōu)(圖6E-J)，Western blot證實其RUNX2和ALP蛋白表達(dá)最高(圖6K-M)。機(jī)制上，水凝膠內(nèi)ZIF-8納米顆粒緩釋Zn2?維持最佳濃度，與木犀草素協(xié)同增強(qiáng)成骨效應(yīng)。木犀草素通過Wnt通路促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化，而適量Zn2?可經(jīng)TGF-β/PI3K-AKT通路激活BMSCs成骨分化。該研究證實LUT@ZIF-8/GelMA支架通過雙因子控釋體系有效促進(jìn)骨再生。
圖 6. 水凝膠支架的體外成骨特性。
3.6 水凝膠支架對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控
生物材料植入骨缺損會引發(fā)異物反應(yīng)，其中巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)對骨修復(fù)至關(guān)重要。本研究通過免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)及基因檢測評估LUT@ZIF-8/GelMA支架的免疫調(diào)控性能(圖7A)。結(jié)果顯示，LUT@ZIF-8/GelMA組顯著抑制M1型標(biāo)志物iNOS表達(dá)，同時促進(jìn)M2型標(biāo)志物CD206表達(dá)(圖7B-C)；流式檢測證實該組M1型巨噬細(xì)胞比例最低(圖7E-F)。RT-qPCR分析顯示其下調(diào)促炎因子TNF-α/IL-1β，上調(diào)抗炎因子IL-4/IL-10(圖7G-J)。支架內(nèi)木犀草素通過調(diào)控STAT3/STAT6磷酸化誘導(dǎo)M2極化，而ZIF-8緩釋的Zn2?協(xié)同增強(qiáng)該效應(yīng)，共同構(gòu)建抗炎微環(huán)境。該雙因子控釋體系為骨再生提供了免疫調(diào)控新策略。
圖7. 水凝膠支架對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)。
3.7 炎癥調(diào)控介導(dǎo)的成骨分化
骨免疫學(xué)揭示了巨噬細(xì)胞在骨修復(fù)中的核心作用：通過直接接觸或分泌外泌體調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。本研究通過構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的炎癥微環(huán)境模型，評估LUT@ZIF-8/GelMA支架調(diào)控巨噬細(xì)胞極化對rBMSCs成骨分化的影響(圖8A)。結(jié)果顯示，經(jīng)該支架處理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基顯著提升rBMSCs的ALP活性(圖8B-D)及礦化結(jié)節(jié)密度(圖8E-F)。RT-qPCR與Western blot證實其成骨基因(RUNX2/COL1A1/ALP/OCN)及蛋白表達(dá)均最優(yōu)(圖8G-M)。機(jī)制上，支架釋放的木犀草素與Zn2?協(xié)同誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化，分泌促修復(fù)細(xì)胞因子，有效逆轉(zhuǎn)炎癥微環(huán)境對成骨分化的抑制作用。該研究闡明免疫調(diào)控-成骨分化級聯(lián)機(jī)制，為構(gòu)建免疫微環(huán)境響應(yīng)型骨修復(fù)材料提供新思路。
圖8. 炎癥調(diào)節(jié)介導(dǎo)的成骨分化。
3.8 生物打印支架的體內(nèi)評估
采用大鼠顱骨缺損模型評估LUT@ZIF-8/GelMA支架的體內(nèi)免疫調(diào)控與成骨性能(圖9A)。術(shù)后8周Micro-CT顯示，LUT@ZIF-8/GelMA組骨再生面積最大，LUT/GelMA與ZIF-8/GelMA組次之，GelMA組最弱(圖9B)。骨體積(BV)與骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)定量分析證實LUT@ZIF-8/GelMA組指標(biāo)顯著優(yōu)于對照組(圖9C-D)。